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冷凍保存細胞之方法？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

實驗要點及說明：

1．本方法適用于貼壁細胞培養，而不適用于懸浮細胞培養，懸浮細胞可使用滴片法；

2．所使用的蓋玻片應該為優質玻璃，并經過鉻酸洗液處理；

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時動作要輕；

4．如果需要更多生長狀態一致的細胞，可以使用較大的培養皿，但不宜過大，以避免培養液的浪費和增加污染機率；

5．如果細胞貼壁生長能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

實驗報告：

一、分離與培養：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸，接種于25cm2培養瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養箱中培養；

5、差速貼壁1h后，吸出培養基，按實驗需要接種于6孔板中繼續培養；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

大鼠 GFRA1 基因全長ORF克隆

大鼠 GM-CSF 基因全長ORF克隆

大鼠 CNTFR 基因全長ORF克隆

大鼠 FCGR2B / CD32b 基因全長ORF克隆

大鼠 FCGR3A / CD16a 基因全長ORF克隆

大鼠 CD64 / FCGR1 基因全長ORF克隆

大鼠 FCGR2A / CD32a 基因全長ORF克隆

大鼠 CD89 / FCAR 基因全長ORF克隆

大鼠 DLL1 基因全長ORF克隆

大鼠 CNTF 基因全長ORF克隆

大鼠角膜上皮細胞78-5000 pg/mL 登革熱病毒通用型(DFV-U)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)

0.156-10 ng/mL ELISA Kit for Human N-glycosylase/DNA lyase

吐溫80營養瓊脂 英文名稱：Lecithin Tween 80 Nutrient Agar 產品規格：250g

7.8-500 ng/mL 人缺血修飾白蛋白(IMA)ELISA試劑盒

0.312-20 ng/mL 人扭轉蛋白2A(TOR2A)ELISA試劑盒

0.78-50 ng/mL ELISA Kit for Human Vitamin K-dependent protein C

匹克氏肉湯基礎B 英文名稱：Pick’s Broth Base B 產品規格：250g

78-5000 pg/mL ELISA Kit for Human Desmoglein-2

0.156-10 ng/mL ELISA Kit for Human Dual specificity protein phosphatase 4

7%羊血瓊脂基礎 英文名稱：7%Sheep Blood Agar Base 產品規格：250g